- Quantificazione assoluta vs relativa a colpo d'occhio
- Quantificazione assoluta mediante metodo PCR digitale
- Quantificazione assoluta utilizzando il metodo della curva standard
- Quantificazione relativa
- Quale metodo devo usare?
Quando si calcolano i risultati dell'esperimento PCR in tempo reale (qPCR), è possibile utilizzare la quantificazione assoluta o relativa.
| Quantificazione assoluta (metodo PCR digitale) | Quantificazione assoluta (metodo della curva standard) | Quantificazione relativa | |
|---|---|---|---|
| Panoramica | Nella quantificazione assoluta mediante PCR digitale, non sono necessari standard noti. L'obiettivo di interesse può essere quantificato direttamente con precisione determinata dal numero di repliche PCR digitali. | Nella quantificazione assoluta utilizzando il metodo della curva standard, si quantificano le incognite in base a una quantità nota. Per prima cosa crei una curva standard; quindi confronti le incognite con la curva standard ed estrapoli un valore. | Nella quantificazione relativa, si analizzano i cambiamenti nell'espressione genica in un dato campione rispetto a un altro campione di riferimento (come un campione di controllo non trattato). |
| Esempio | Quantificare le copie dell'allele raro presente in miscele eterogenee. Contare il numero di cellule equivalenti nel campione prendendo di mira il DNA genomico. Determinare il numero assoluto di copie virali presenti in un dato campione senza riferimento a uno standard. | Correlazionenumero di copia viralecon uno stato di malattia. | Misurareespressione genicain risposta a un farmaco. In questo esempio, confronterai il livello di espressione genica di un particolare gene di interesse in un campione trattato chimicamente rispetto al livello di espressione genica in un campione non trattato. |
SUPERIORE
La PCR digitale funziona suddividendo un campione in molte singole reazioni di PCR in tempo reale; alcune parti di queste reazioni contengono la molecola bersaglio (positiva), mentre altre no (negativa). Dopo l'analisi PCR, la frazione di risposte negative viene utilizzata per generare una risposta assoluta per il numero esatto di molecole target nel campione, senza riferimento a standard o controlli endogeni.
Figura 1:La PCR digitale utilizza il rapporto tra reazioni PCR positive (bianche) e negative (nere) per contare il numero di molecole target.
SUPERIORE
Il metodo della curva standard per la quantificazione assoluta è simile al metodo della curva standard per la quantificazione relativa, tranne per il fatto che le quantità assolute degli standard devono essere prima conosciute con mezzi indipendenti.
Figura 2:Grafico di amplificazione e curva standard per la quantificazione assoluta
Linee guida critiche
Le linee guida seguenti sono fondamentali per un uso corretto del metodo della curva standard per la quantificazione assoluta:
- È importante che il DNA o l'RNA siano un'unica specie pura. Ad esempio, il DNA plasmidico preparato da E. coli è spesso contaminato con RNA, che aumenta la misurazione A260 e gonfia il numero di copie determinato per il plasmide.
- È necessario un pipettaggio accurato perché gli standard devono essere diluiti su diversi ordini di grandezza. Il DNA plasmidico o l'RNA trascritto in vitro devono essere concentrati per misurare un valore A260 accurato. Questo DNA o RNA concentrato deve quindi essere diluito 106-1012 volte per essere a una concentrazione simile al bersaglio nei campioni biologici.
- La stabilità degli standard diluiti deve essere considerata, specialmente per l'RNA. Dividere gli standard diluiti in piccole aliquote, conservare a –80 °C e scongelare solo una volta prima dell'uso.
Generalmente non è possibile utilizzare il DNA come standard per la quantificazione assoluta dell'RNA perché non esiste alcun controllo per l'efficienza della fase di trascrizione inversa.
Standard
Le quantità assolute degli standard devono essere prima conosciute con mezzi indipendenti. Il DNA plasmidico e l'RNA trascritto in vitro sono comunemente usati per preparare standard assoluti. La concentrazione viene misurata da A260 e convertita nel numero di copie utilizzando il peso molecolare del DNA o dell'RNA.
SUPERIORE
Metodi di calcolo per la quantificazione relativa
La quantificazione relativa può essere eseguita con i dati di tutti gli strumenti PCR in tempo reale. I metodi di calcolo utilizzati per la quantificazione relativa sono:
- Metodo della curva standard
- Metodo TC comparativo
Figura 3:Quantificazione relativa
SUPERIORE
Panoramica | ||
| Metodo PCR digitale | Metodo della curva standard | Metodo TC comparativo |
|---|---|---|
| La quantificazione dell'acido nucleico utilizza la teoria della limitazione della diluizione del campione che si sviluppa in molte reazioni tecniche di PCR replicate. La quantificazione assoluta è determinata dal rapporto tra il numero di reazioni negative rispetto al totale. Questo tipo di analisi è diverso dai confronti Ct e delta Ct e consente invece di quantificare indipendentemente ciascun target analizzato senza la necessità di standard di riferimento. | È facile preparare curve standard per la quantificazione relativa poiché la quantità è espressa rispetto a un campione di base (chiamato calibratore), come un controllo non trattato. Per tutti i campioni sperimentali, si determina la quantità target dalla curva standard e la si divide per la quantità target del calibratore. Pertanto, il calibratore diventa il campione 1 × e tutte le altre quantità sono espresse come una differenza n volte rispetto al calibratore. | Questo metodo confronta il valore Ct di un gene bersaglio con un altro (usando la formula: 2ΔΔCT) — ad esempio, un controllo interno o un gene di riferimento (ad esempio, gene housekeeping) — in un singolo campione. |
Vantaggi | ||
| Non c'è bisogno di fare affidamento su riferimenti o standard. La precisione desiderata può essere raggiunta aumentando il numero totale di repliche PCR. Altamente tollerante agli inibitori. In grado di analizzare miscele complesse. A differenza della qPCR tradizionale, la PCR digitale fornisce una risposta lineare al numero di copie presenti per consentire il rilevamento di piccole differenze di cambiamento | L'esecuzione delle amplificazioni target e di controllo endogeno in provette separate e l'utilizzo del metodo di analisi della curva standard richiede la minima quantità di ottimizzazione e convalida. | Non è necessaria una curva standard e si può aumentare la produttività perché non è più necessario utilizzare i pozzetti per i campioni della curva standard. Ciò elimina anche gli errori di diluizione commessi nella creazione dei campioni della curva standard. È possibile amplificare il target e il controllo endogeno nella stessa provetta, aumentando la produttività e riducendo gli errori di pipettaggio. Quando l'RNA è il modello, l'esecuzione dell'amplificazione nella stessa provetta fornisce una certa normalizzazione rispetto a variabili come l'integrità dell'RNA e l'efficienza della trascrizione inversa. |
Validazione sperimentale | ||
| Risultati PCR digitali convalidati con confronto affiancato con un campione ben caratterizzato con numero di copie noto. | Vedi Vantaggi sopra. | È necessario eseguire un esperimento di convalida per dimostrare che le efficienze delle amplificazioni del bersaglio e del controllo endogeno sono approssimativamente uguali. Per amplificare il target e il controllo endogeno nella stessa provetta, è necessario identificare le concentrazioni limite dei primer e dimostrare che non influenzano i valori CT. |
Linee guida critiche | ||
| È importante utilizzare il più possibile materie plastiche a basso legame durante l'allestimento sperimentale. Poiché la PCR digitale pone l'accento sulla limitazione della diluizione del dosaggio, qualsiasi campione che si attacca all'apparecchiatura di configurazione intermedia andrà perso e distorcerà i risultati. Si consiglia di utilizzare provette da 2,0 mL a basso legame per diluizioni e puntali per pipette a bassa ritenzione. È importante conoscere l'area digitale del campione desiderato da testare. Se sconosciuto, consultare la guida per l'utente per assistenza nella determinazione del numero di copie di specie note (gDNA) o eseguire un esperimento di screening preliminare con più diluizioni della combinazione campione/dosaggio per determinare la concentrazione digitale ottimale per garantire il raggiungimento di dati significativi. Il campione non deve essere conservato a basse concentrazioni per periodi di tempo prolungati, né esposto a congelamento-scongelamento eccessivo. I vettori non hanno dimostrato di essere così importanti per la riproducibilità tanto quanto l'utilizzo di plastica antiaderente per l'allestimento sperimentale. Si desidera un'attenta pianificazione delle diluizioni per ridurre al minimo la variabilità dovuta allo schema di diluizione. | È importante che l'RNA o il DNA di riserva siano accuratamente diluiti, ma le unità utilizzate per esprimere questa diluizione sono irrilevanti. Se vengono utilizzate diluizioni doppie di una preparazione di RNA totale da una linea cellulare di controllo per costruire una curva standard, le unità potrebbero essere i valori di diluizione 1, 0,5, 0,25, 0,125 e così via. Utilizzando lo stesso RNA o DNA di riserva per preparare curve standard per più piastre, le quantità relative determinate possono essere confrontate tra le piastre. È possibile utilizzare una curva standard del DNA per la quantificazione relativa dell'RNA. In questo modo si presuppone che l'efficienza di trascrizione inversa del bersaglio sia la stessa in tutti i campioni, ma non è necessario conoscere il valore esatto di questa efficienza. Per la quantificazione normalizzata rispetto a un controllo endogeno, vengono preparate curve standard sia per il target che per il riferimento endogeno. Per ogni campione sperimentale, la quantità di target e riferimento endogeno è determinata dalla curva standard appropriata. Quindi, l'importo obiettivo viene diviso per l'importo di riferimento endogeno per ottenere un valore obiettivo normalizzato. Ancora una volta, uno dei campioni sperimentali è il calibratore, o campione 1×. Ciascuno dei valori target normalizzati viene diviso per il valore target normalizzato del calibratore per generare i relativi livelli di espressione. | Affinché il metodo CT comparativo sia valido, l'efficienza dell'amplificazione target (il gene di interesse) e l'efficienza dell'amplificazione di riferimento (il controllo endogeno) devono essere approssimativamente uguali. |
Controllo endogeno | ||
| La PCR digitale non si basa sulla presenza di controlli endogeni per le misurazioni di riferimento. | L'amplificazione di un controllo endogeno può essere eseguita per standardizzare la quantità di RNA o DNA del campione aggiunto a una reazione. Per la quantificazione dell'espressione genica, i ricercatori hanno utilizzato ß-actina, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), RNA ribosomiale (rRNA) o altri RNA come controllo endogeno. | |
Standard | ||
| Poiché la PCR digitale utilizza la frazione di replicati negativi rispetto al totale per determinare un conteggio assoluto di molecole, non sono richiesti standard. | Poiché la quantità del campione è divisa per la quantità del calibratore, l'unità dalla curva standard scompare. Pertanto, tutto ciò che è richiesto agli standard è che siano note le loro relative diluizioni. Per la quantificazione relativa, ciò significa che qualsiasi RNA o DNA stock contenente il target appropriato può essere utilizzato per preparare gli standard. |
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FAQs
What is the difference between absolute qPCR and relative qPCR? ›
What is the difference between Absolute Quantification and Relative Quantification in qPCR, using the standard curve approach? Absolute Quantification determines expression levels in absolute numbers of copies. Relative Quantification determines fold changes in expression between two samples.
What is the difference between relative and absolute quantification in PCR? ›Absolute quantification determines the input copy number, usually by relating the PCR signal to a standard curve. Relative quantification relates the PCR signal of the target transcript in a treatment group to that of another sample such as an untreated control.
What are the different types of qPCR quantification? ›Two methods are available for quantification of gene expression by RT-qPCR: two-step RT-qPCR and one-step RT-qPCR. In both cases, RNA is reverse transcribed into cDNA, and the cDNA is then used as the template for qPCR amplification.
What is the difference between standard curve and relative quantification? ›First you create a standard curve; then you compare unknowns to the standard curve and extrapolate a value. In relative quantification, you analyze changes in gene expression in a given sample relative to another reference sample (such as an untreated control sample).
What is relative qPCR? ›What is Relative Quantification? Relative quantification in qPCR is where you measure gene expression levels by comparing the levels of expression of your gene of interest against the levels of expression of an internal control gene.
What is the difference between QT and RT PCR? ›To sum up, RT-PCR and qPCR are the advanced methods of PCR or polymerase chain reaction. qPCR gives faster, more detailed real-time results and is used to quantify nucleic acids. RT-PCR is used to detect and amplify cDNA. Explore all the important topics aligned with the updated NEET syllabus only at BYJU'S.
Why is relative difference better than absolute difference? ›Relative difference allows us to understand the comparative ratio of two numbers – often expressed as a percentage – that gives us a direct insight into the true scale of difference between our control and treatment.
What is the difference between absolute and relative absolute? ›Absolute change refers to the simple difference in the indicator over two periods in time, i.e. Relative change expresses the absolute change as a percentage of the value of the indicator in the earlier period, i.e.
What is the difference between relative and absolute difference? ›Relative is always in proportion to a whole. Absolute is the total of all existence. 2. Relative is dependent while absolute is independent.
What are the two methods of qPCR? ›The two strategies for analyzing qPCR data are absolute and relative quantification (1–3). Absolute quantification identifies the input gene amount based on a standard curve. In contrast, relative quantification determines changes in gene expression relative to a reference sample.
What is RFU in qPCR? ›
The terms "relative fluorescence units" (RFU) and "RFU peak" refer to measurements in electrophoresis methods, such as for DNA analysis. A "relative fluorescence unit" is a unit of measurement used in analysis which employs fluorescence detection.
What is cq and Ct in qPCR? ›The quantitative analysis of RT-qPCR is obtained through analysis of the quantification of cycle (Cq) values. The Cq value has been given many different names including: Ct — threshold cycle. Cp — crossing point.
What is the difference between relative standard and absolute standard? ›The Relative rating system “compares the performance of workers against their peers and uses the effect of competition in the workplace to incite workers to increase performance,” whereas the Absolute rating system “awards high ratings to workers when their performance meets or exceeds a standard threshold.”
Do you need a standard curve for qPCR? ›Designing and testing the qPCR primers using a standard curve is an absolute must before doing any qPCR experiments! Making sure that the obtained Ct values are valuable and reflect reality is important.
What is relative quantification standard curve method? ›Relative standard curve method uses a set of relative standards from which unknown samples are quantitated. Standard curves for relative quantification are easy to prepare because quantity is expressed relative to some basis sample, such as the calibrator, a sample used as the basis for comparing results.
How do you calculate relative quantification in qPCR? ›In an ideal reaction, the amplification efficiency is close to one, which leads to the equation r = 2-ΔΔCq for relative quantification of gene expression.
How do you choose a reference gene for qPCR? ›The best way of selecting the most appropriate control gene for a relative qPCR experiment is to select some candidate genes and determine their expression levels across the range of experimental conditions and treatments. The genes most stably expressed across these conditions will be the most appropriate controls.
How to compare data in qPCR? ›There are two main ways to analyze qPCR data: double delta Ct analysis and the relative standard curve method (Pfaffl method). Both methods make assumptions and have their limitations, so the method you should use for your analysis will depend on your experimental design.
Is it better to do antigen or RT-PCR? ›Although it is less sensitive than the RT-PCR test, the antigen test is an effective way to monitor infection in people who are in close contact with COVID-19 infected. Rapid antigen tests are often used as mass screening tests to detect SARS-CoV-2 infection quickly in containment zones or healthcare settings.
Is RT-PCR better than antigen? ›While the cost-effective rapid antigen test is quite useful in conducting mass screening tests, the accuracy of RT PCR is always necessary for a confirmed diagnosis.
What is the difference between real time PCR and RT-PCR? ›
Real-time PCR allows for the detection of PCR amplification in the exponential growth phase of the reaction and is much more quantitative than traditional RT-PCR. Although a number of kits and reagents for RT-PCR and real-time PCR are commercially available, the basic principles are the same.
Is relative or absolute more accurate? ›However, the relative values appeared to be more constant. Our results demonstrated that the measurement accuracy was analytically much higher for the relative values compared with the absolute values. This finding applied to all of the devices of the modern hematology systems.
Is absolute or relative better? ›A relative URL is useful within a site to transfer a user from point to point within the same domain. Absolute links are good when you want to send the user to a page that is outside of your server.
What is the difference between absolute value and relative value philosophy? ›Absolute and Relative are philosophical terms concerning the mutual interdependence of things, processes and knowledge. 'Absolute' means independent, permanent and not subject to qualification. 'Relative' means partial or transient, dependent on circumstances or point-of-view.
What is the difference between absolute measure and relative measure? ›Absolute measures of dispersion use the original units of data. They are most useful for understanding the dispersion within the sample. Relative measures of dispersion are calculated as ratios or percentage. One of the relative measures of dispersion is the ratio of the standard deviation to the mean.
What is the main difference between absolute and relative locations? ›An absolute location describes a precise point on Earth or another defined space. A relative location describes where something else by using another, familiar feature as a reference point.
What is the difference between absolute and relative risk? ›Absolute risks help put into perspective how much benefit an individual is likely to have from a treatment or prevention. The relative risk can help us find disparities, like if one group is having better outcomes than another.
What is the difference between absolute and relative frequency? ›A relative frequency describes the number of times a particular value for a variable (data item) has been observed to occur in relation to the total number of values for that variable. The relative frequency is calculated by dividing the absolute frequency by the total number of values for the variable.
What is relative vs absolute in psychology? ›The relative value of an object is dependent on the values of the other available objects in the same context (e.g., higher or lower), whereas the absolute value of an object is not influenced by the values of other available objects (e.g., 50 points).
Which of the following is a unique feature of qPCR compared to the original PCR? ›Real-time PCR is quite different from normal PCR but the fundamental principles are the same for both. However, in qPCR, we can quantify the amount transcript present after each PCR round. This is done by measuring the intensity of a fluorescent probe or dye which binds to double-stranded DNA and emits fluorescence.
What is the major difference between qPCR and digital PCR? ›
qPCR provides high throughput and wide dynamic range, which is useful for screening large numbers of samples. dPCR offers unparalleled sensitivity for fractional abundance (mutant/wild-type ratio) and exquisite precision.
What is the difference between the one step qPCR and two step qPCR? ›In one-step RT-qPCR, cDNA synthesis and qPCR are performed in a single reaction vessel in a common reaction buffer. In two-step RT-qPCR, cDNA is synthesized in one reaction, and an aliquot of the cDNA is then used for a subsequent qPCR experiment.
How is RFU calculated in qPCR? ›Zn concentration in sample ( ng / mL ) = [ RFU sample – blank / RFU ( spiked sample ) – blank ] × Concentration added standard ( ng / mL ) × dilution factor , where RFU is the Relative Fluorescence Unit or the emission readings acquired by the instrument.
Is qRT-PCR and RT-qPCR the same? ›The final acronym 'RT-qPCR' is used for reverse transcription quantitative real-time PCR. This is a technique which combines RT-PCR with qPCR to enable the measurement of RNA levels through the use of cDNA in a qPCR reaction, thus allowing rapid detection of gene expression changes (see Figure 1C).
What does RFU measure? ›The intensity of the fluorescent signal is usually relative to other measurements or to a refence measurement taken by an instrument. Consequently, fluorescence plate readers measure the light signal emitted by a sample in Relative Fluorescent Units (RFU).
Why is the Ct or CQ number so important in qPCR results? ›This value tells how many cycles it took to detect a real signal from your samples. Real-Time PCR runs will have a reaction curve for each sample and therefore many Cq values. Your cycler's software calculates and charts the Cq value for each of your samples.
What if there is no Ct value in qPCR? ›If you do not see a CT value, then your gene did NOT amplify. Do NOT just make up an amplification number. You can try increasing the amount of template and take that into account in your calculations. To add to that, 40 cycles is a subjective cut-off value for PCR cycles.
Why qPCR is the gold standard for COVID 19 testing? ›This means that COVID-19 RT-qPCR tests are not only able to detect the virus's genetic information, they are also able to quantify the amount of that genetic information that is present in a sample.
Why is relative standard deviation better? ›The higher the relative standard deviation, the more spread out the results are from the mean of the data. On the other hand, a lower relative standard deviation means that the measurement of data is more precise.
Is relative standard deviation same as accuracy? ›These are exactly the same thing and are a standardised way of measuring dispersion, the spread of your results. The lower the RSD, the smaller the spread of your results and the higher their precision.
What is relative standards measurement? ›
A relative standard is one that adjusts the specification for each level of pass or success depending on the performance of the student cohort. For example, the percentage of first-class degree may be kept constant and so the pass mark will vary from year to year.
What is the ideal standard curve for qPCR? ›Standard curves are useful for optimizing qPCR experiments, which is done by setting up qPCR reactions to amplify using different amounts of the same DNA sample. Ideally, you would need at least five data points over several orders of magnitude (5- to 10- fold dilutions)—to get a good standard curve.
How much standard deviation is acceptable in qPCR? ›The standard deviation is calculated by the software with the delta Ct value of the technical triplicates. The triplicates are valid when the SD is smaller than 0.25. If the SD is over 0.25, the RQ value is considered unreliable.
How do you calculate qPCR efficiency from standard curve? ›Finally, efficiency is calculated using the equation: E = -1+10(-1/slope). Or use this calculator which does the work for you. Be sure to understand what influences the slope of the amplification curve, as it can otherwise be misleading. Typically, desired amplification efficiencies range from 90% to 110%.
What is relative quantification in Quant studio? ›The Relative Quantification Analysis Module for QuantStudio™ Design and Analysis Software v2 is used determine the relative quantity of a target of interest in a test sample relative to a reference sample.
What is a standard curve and how is it used in quantitative chemical analysis? ›In analytical chemistry, a calibration curve, also known as a standard curve, is a general method for determining the concentration of a substance in an unknown sample by comparing the unknown to a set of standard samples of known concentration.
What is the difference between qPCR? ›The main difference between PCR and qPCR is that qPCR is a real-time method, while PCR is not. This means that with qPCR, you can monitor the amplification of your target DNA in real-time as it is happening.
Is qPCR absolute quantification? ›The current gold standard in qPCR is absolute quantification using standard curves.
How do you compare qPCR results? ›There are two main ways to analyze qPCR data: double delta Ct analysis and the relative standard curve method (Pfaffl method). Both methods make assumptions and have their limitations, so the method you should use for your analysis will depend on your experimental design.
What is the difference between absolute difference and relative difference? ›Absolute change refers to the simple difference in the indicator over two periods in time, i.e. Relative change expresses the absolute change as a percentage of the value of the indicator in the earlier period, i.e.
Is QRT PCR and RT-qPCR the same? ›
The final acronym 'RT-qPCR' is used for reverse transcription quantitative real-time PCR. This is a technique which combines RT-PCR with qPCR to enable the measurement of RNA levels through the use of cDNA in a qPCR reaction, thus allowing rapid detection of gene expression changes (see Figure 1C).
Is CT the same as CQ in qPCR? ›There is no difference a Ct means cycle threshold, Cq quantification cycle. Ct and Cq are the same. But the application method of this value could result in different results. There are multiple methods for qPCR data analysis focusing the inaccurate results due to perfect amplification assumption.
What is the relative standard curve method of quantification? ›Relative standard curve method uses a set of relative standards from which unknown samples are quantitated. Standard curves for relative quantification are easy to prepare because quantity is expressed relative to some basis sample, such as the calibrator, a sample used as the basis for comparing results.
What is relative gene expression? ›The relative expression is based on the expression ratio of a target gene versus a reference gene and is adequate for most purposes to investigate physiological changes in gene expression levels.
Why is quantitative PCR sometimes called real-time PCR? ›Thermal cyclers meant for use with qPCR include a fluorometer to detect that fluorescence. The fluorometer detects that fluorescence in real time as the thermal cycler runs, giving readings throughout the amplification process of the PCR. As a result, quantitative PCR is also called real-time PCR or RT-PCR.
Which statistical test should I use for qPCR? ›If you are comparing more than two groups, you should use Analysis of variance ANOVA (a parametric test) or a Kruskal-Wallis (a non-parametric test). To sum up a few tips: use t-tests (or ANOVA) unless the data are obviously non-normally distributed, are in the form of ranks or you have small sample groups.